Kromatografi cair minangka cara utama kanggo nguji isi saben komponen lan impurities ing bahan mentah, intermediet, preparat lan bahan kemasan, nanging akeh zat sing ora duwe metode standar sing bisa diandelake, mula ora bisa dihindari kanggo ngembangake metode anyar. Ing pangembangan metode fase cair, kolom kromatografi minangka inti saka kromatografi cair, mula penting banget kanggo milih kolom kromatografi sing cocog. Ing artikel iki, penulis bakal nerangake carane milih kolom kromatografi cair saka telung aspek: gagasan sakabèhé, pertimbangan lan ruang lingkup aplikasi.
A. Sakabèhé gagasan kanggo milih kolom kromatografi cair
1. Evaluasi sifat fisik lan kimia analit: kayata struktur kimia, kelarutan, stabilitas (kayata apa gampang dioksidasi / dikurangi / dihidrolisis), keasaman lan alkalinitas, lan liya-liyane, utamane struktur kimia minangka kunci. faktor kanggo nemtokake sifat, kayata klompok conjugated nduweni panyerepan ultraviolet kuwat lan fluoresensi kuwat;
2. Nemtokake tujuan analisis: apa pemisahan dhuwur, efisiensi kolom dhuwur, wektu analisis sing cendhak, sensitivitas dhuwur, resistensi tekanan dhuwur, urip kolom sing dawa, biaya murah, lan liya-liyane;
- Pilih kolom kromatografi sing cocog: ngerti komposisi, sifat fisik lan kimia saka pengisi kromatografi, kayata ukuran partikel, ukuran pori, toleransi suhu, toleransi pH, adsorpsi analit, lsp.
- Pertimbangan kanggo milih kolom kromatografi cair
Bab iki bakal ngrembug faktor-faktor sing kudu digatekake nalika milih kolom kromatografi saka sudut pandang sifat fisik lan kimia kolom kromatografi kasebut. 2.1 Matriks pangisi
2.1.1 Matriks gel silika Matriks pengisi sebagian besar kolom kromatografi cair yaiku gel silika. Pengisi jinis iki nduweni kemurnian sing dhuwur, biaya murah, kekuatan mekanik sing dhuwur, lan gampang diowahi klompok (kayata ikatan fenil, ikatan amino, ikatan cyano, lan sapiturute), nanging nilai pH lan kisaran suhu sing ditrima diwatesi: Kisaran pH paling akeh pengisi matriks silika gel yaiku 2 nganti 8, nanging kisaran pH fase ikatan silika gel sing diowahi khusus bisa nganti 1.5 nganti 10, lan ana uga fase ikatan silika gel sing diowahi khusus sing stabil ing pH sing sithik, kayata Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, sing stabil ing pH 1 nganti 8; wates suhu ndhuwur matriks gel silika biasane 60 ℃, lan sawetara kolom kromatografi bisa ngidinke suhu 40 ℃ ing pH dhuwur.
2.1.2 Matriks polimer Pangisi polimer biasane polystyrene-divinylbenzene utawa polymethacrylate. Kaluwihan kasebut yaiku bisa ngidinke kisaran pH sing amba - bisa digunakake ing kisaran 1 nganti 14, lan luwih tahan kanggo suhu dhuwur (bisa tekan ndhuwur 80 °C). Dibandhingake karo pangisi C18 adhedhasar silika, jinis pangisi iki nduweni hidrofobik sing luwih kuat, lan polimer macroporous efektif banget kanggo misahake conto kayata protein. Kekurangane yaiku efisiensi kolom luwih murah lan kekuatan mekanik luwih lemah tinimbang pengisi basis silika. 2.2 Wujud partikel
Umume pangisi HPLC modern minangka partikel bunder, nanging kadhangkala minangka partikel sing ora teratur. Partikel bunder bisa nyedhiyakake tekanan kolom sing luwih murah, efisiensi kolom sing luwih dhuwur, stabilitas lan umur sing luwih dawa; nalika nggunakake fase seluler viskositas dhuwur (kayata asam fosfat) utawa nalika solusi sampel kenthel, partikel sing ora duwe aturan baku duwe area lumahing spesifik sing luwih gedhe, sing luwih kondusif kanggo tumindak lengkap saka rong fase kasebut, lan regane relatif murah. 2.3 Ukuran partikel
Ukuran partikel sing luwih cilik, efisiensi kolom sing luwih dhuwur lan pemisahan sing luwih dhuwur, nanging luwih elek resistensi tekanan dhuwur. Kolom sing paling umum digunakake yaiku kolom ukuran partikel 5 μm; yen syarat pamisahan dhuwur, pangisi 1.5-3 μm bisa dipilih, sing cocog kanggo ngrampungake masalah pemisahan sawetara conto matriks kompleks lan multi-komponen. UPLC bisa nggunakake pangisi 1,5 μm; Pengisi ukuran partikel 10 μm utawa luwih gedhe asring digunakake kanggo kolom semi-preparative utawa preparative. 2.4 Kandungan karbon
Isi karbon nuduhake proporsi fase terikat ing permukaan gel silika, sing ana hubungane karo area permukaan tartamtu lan jangkoan fase terikat. Isi karbon dhuwur nyedhiyakake kapasitas kolom dhuwur lan resolusi dhuwur, lan asring digunakake kanggo conto kompleks sing mbutuhake pemisahan sing dhuwur, nanging amarga wektu interaksi dawa antarane rong fase, wektu analisis dawa; kolom kromatografi isi karbon kurang duwe wektu analisis luwih cendhek lan bisa nuduhake selektivitas beda, lan asring digunakake kanggo conto prasaja sing mbutuhake analisis cepet lan conto sing mbutuhake kahanan phase banyu dhuwur. Umumé, isi karbon C18 antara 7% nganti 19%. 2.5 Ukuran pori lan area lumahing tartamtu
Media adsorpsi HPLC minangka partikel keropos, lan umume interaksi dumadi ing pori-pori. Mulane, molekul kudu mlebu ing pori-pori kanggo adsorbed lan dipisahake.
Ukuran pori lan area permukaan spesifik minangka rong konsep pelengkap. Ukuran pori cilik tegese area permukaan spesifik sing gedhe, lan kosok balene. A area lumahing tartamtu gedhe bisa nambah interaksi antarane molekul sampel lan fase terikat, nambah retensi, nambah loading sampel lan kapasitas kolom, lan misahake komponen Komplek. Pengisi keropos kanthi lengkap kalebu jinis pengisi iki. Kanggo sing nduweni syarat pamisahan sing dhuwur, dianjurake kanggo milih pangisi kanthi area permukaan spesifik sing gedhe; area lumahing tartamtu cilik bisa nyuda meksa bali, nambah efficiency kolom, lan ngurangi wektu keseimbangn, kang cocok kanggo analisis gradien. Pengisi cangkang inti kalebu jinis pengisi iki. Ing premis kanggo mesthekake pemisahan, disaranake milih pangisi kanthi area permukaan khusus cilik kanggo sing duwe syarat efisiensi analisis sing dhuwur. 2.6 Volume pori lan kekuatan mekanik
Volume pori, uga dikenal minangka "volume pori", nuduhake ukuran volume void per unit partikel. Bisa uga nggambarake kekuwatan mekanik pengisi. Kekuwatan mekanik pengisi kanthi volume pori gedhe rada luwih lemah tinimbang pengisi kanthi volume pori cilik. Pangisi kanthi volume pori kurang saka utawa padha karo 1.5 mL / g biasane digunakake kanggo pamisahan HPLC, dene pangisi kanthi volume pori luwih saka 1.5 mL / g utamane digunakake kanggo kromatografi pengecualian molekul lan kromatografi tekanan rendah. 2.7 Capping rate
Capping bisa nyuda puncak tailing sing disebabake dening interaksi antarane senyawa lan gugus silanol sing kapapar (kayata ikatan ion antarane senyawa alkali lan gugus silanol, gaya van der Waals lan ikatan hidrogen antarane senyawa asam lan gugus silanol), saéngga ningkatake efisiensi kolom lan wangun puncak. . Fase ikatan sing ora ditutup bakal ngasilake selektivitas sing beda karo fase ikatan sing ditutup, utamane kanggo conto polar.
- Ruang lingkup aplikasi kolom kromatografi cair sing beda
Bab iki bakal njlèntrèhaké ruang lingkup aplikasi saka macem-macem jinis kolom kromatografi cair liwat sawetara kasus.
3.1 Kolom kromatografi C18 fase terbalik
Kolom C18 minangka kolom fase terbalik sing paling umum digunakake, sing bisa nyukupi tes isi lan impurity saka umume bahan organik, lan ditrapake kanggo bahan medium-polar, polar lemah lan non-polar. Jinis lan spesifikasi kolom kromatografi C18 kudu dipilih miturut syarat pamisahan tartamtu. Contone, kanggo zat kanthi syarat pamisahan dhuwur, spesifikasi 5 μm * 4,6 mm * 250 mm asring digunakake; kanggo zat kanthi matriks pemisahan kompleks lan polaritas sing padha, spesifikasi 4 μm * 4,6 mm * 250 mm utawa ukuran partikel sing luwih cilik bisa digunakake. Contone, penulis nggunakake kolom 3 μm * 4,6 mm * 250 mm kanggo ndeteksi loro impurities genotoxic ing celecoxib API. Pemisahan rong zat kasebut bisa tekan 2,9, sing apik banget. Kajaba iku, miturut premis kanggo njamin pemisahan, yen analisis cepet dibutuhake, kolom cendhak 10 mm utawa 15 mm asring dipilih. Contone, nalika penulis nggunakake LC-MS / MS kanggo ndeteksi impurity genotoxic ing piperaquine fosfat API, kolom 3 μm * 2,1 mm * 100 mm digunakake. Pemisahan antarane impurity lan komponen utama yaiku 2.0, lan deteksi sampel bisa rampung sajrone 5 menit. 3.2 Kolom fenil fase terbalik
Kolom fenil uga minangka jinis kolom fase terbalik. Kolom jinis iki nduweni selektivitas sing kuat kanggo senyawa aromatik. Yen respon senyawa aromatik sing diukur karo kolom C18 biasa lemah, sampeyan bisa nimbang ngganti kolom fenil. Contone, nalika aku nggawe celecoxib API, respon komponen utama diukur dening kolom fenil saka Produsèn padha lan specifications padha (kabeh 5 μm * 4,6 mm * 250 mm) ana bab 7 kaping kolom C18. 3.3 Kolom fase normal
Minangka tambahan sing efektif kanggo kolom fase terbalik, kolom fase normal cocok kanggo senyawa polar banget. Yen puncak isih cepet banget nalika eluting karo luwih saka 90% fase banyu ing kolom fase mbalikke, lan malah cedhak lan tumpang tindih karo puncak solvent, sampeyan bisa nimbang ngganti kolom normal-phase. Kolom jinis iki kalebu kolom hilik, kolom amino, kolom cyano, lsp.
3.3.1 Kolom hilik Kolom hilik biasane nglebokake gugus hidrofilik ing rantai alkil ikatan kanggo nambah respon marang zat polar. Kolom jinis iki cocog kanggo analisis zat gula. Penulis nggunakake kolom jinis iki nalika nindakake konten lan zat sing ana gandhengane karo xilosa lan turunane. Isomer saka turunan xylose uga bisa dipisahake kanthi apik;
3.3.2 Kolom amino lan kolom cyano Kolom amino lan kolom cyano nuduhake introduksi modifikasi amino lan cyano ing pungkasan rantai alkil sing diikat, masing-masing, kanggo nambah selektivitas kanggo zat khusus: contone, kolom amino minangka pilihan sing apik. kanggo misahake gula, asam amino, basa, lan amida; kolom cyano nduweni selektivitas sing luwih apik nalika misahake bahan struktural sing padha hidrogenasi lan ora dihidrogenasi amarga ana ikatan konjugasi. Kolom amino lan kolom cyano asring bisa dialihake ing antarane kolom fase normal lan kolom fase mbalikke, nanging ora dianjurake kanggo ngoper sing kerep. 3.4 Kolom kiral
Kolom kiral, minangka jeneng kasebut, cocok kanggo pamisahan lan analisis senyawa kiral, utamane ing bidang farmasi. Kolom jinis iki bisa dianggep nalika fase mbalikke konvensional lan kolom fase normal ora bisa misahake isomer. Contone, penulis nggunakake kolom kiral 5 μm * 4,6 mm * 250 mm kanggo misahake rong isomer saka 1,2-diphenylethylenediamine: (1S, 2S) -1, 2-diphenylethylenediamine lan (1R, 2R) -1, 2 -diphenylethylenediamine, lan pamisahan antarane loro tekan bab 2.0. Nanging, kolom kiral luwih larang tinimbang jinis kolom liyane, biasane 1W + / potongan. Yen ana perlu kanggo kolom kuwi, unit kudu nggawe budget cekap. 3.5 Kolom pertukaran ion
Kolom pertukaran ion cocok kanggo pamisahan lan analisis ion sing diisi, kayata ion, protein, asam nukleat, lan sawetara zat gula. Miturut jinis pengisi, dipérang dadi kolom ijol-ijolan kation, kolom ijol-ijolan anion, lan kolom ijol-ijolan kation sing kuwat.
Kolom pertukaran kation kalebu kolom basis kalsium lan hidrogen, sing utamané cocok kanggo analisis zat kationik kayata asam amino. Contone, penulis nggunakake kolom basis kalsium nalika nganalisa kalsium glukonat lan kalsium asetat ing solusi siram. Kaloro zat kasebut nduweni respon sing kuat ing λ=210nm, lan derajat pamisahan tekan 3.0; penulis nggunakake kolom adhedhasar hidrogen nalika nganalisa zat sing ana gandhengane karo glukosa. Sawetara zat sing gegandhengan - maltosa, maltotriose lan fruktosa - nduweni sensitivitas dhuwur ing detektor diferensial, kanthi watesan deteksi kurang saka 0,5 ppm lan tingkat pamisahan 2,0-2,5.
Kolom pertukaran anion utamané cocok kanggo analisis zat anionik kayata asam organik lan ion halogen; kolom exchange kation kuwat duwe kapasitas exchange ion luwih lan selektivitas, lan cocok kanggo misahake lan analisis conto Komplek.
Ing ndhuwur mung minangka pambuka kanggo jinis lan kisaran aplikasi sawetara kolom kromatografi cair umum sing digabungake karo pengalaman penulis dhewe. Ana jinis khusus kolom kromatografi liyane ing aplikasi nyata, kayata kolom kromatografi pori gedhe, kolom kromatografi pori cilik, kolom kromatografi afinitas, kolom kromatografi multimode, kolom kromatografi cair kinerja ultra-tinggi (UHPLC), kolom kromatografi cairan superkritis ( SFC), lan liya-liyane. Dheweke duwe peran penting ing macem-macem lapangan. Jinis spesifik kolom kromatografi kudu dipilih miturut struktur lan sifat sampel, syarat pamisahan lan tujuan liyane.
Wektu kirim: Jun-14-2024